目前，藥用抗體的研發(fā)主要基于雜交瘤細胞或者體外抗體庫。通過(guò)抗原設計和抗體篩選，人們初步獲得陽(yáng)性的hits，再進(jìn)一步通過(guò)一系列生物性質(zhì)檢測和功能驗證，最終得到有藥用潛力的抗體。在實(shí)際研發(fā)過(guò)程中，經(jīng)過(guò)了常規篩選所得的抗體，有諸多方面需要更細致的改進(jìn)，包括親和力、免疫原性、半衰期等等，抗體領(lǐng)域這些年來(lái)做了很多相關(guān)的研究和實(shí)踐。其中，抗體親和力成熟是研究的重要方向之一。理論上，抗體親和力的提高有助于改善抗體的特異性和效力，有助于減少用藥劑量，降低毒副作用等。雖然實(shí)際的研究工作證明親和力的提高與抗體效價(jià)的提高并不總是線(xiàn)性的關(guān)系，尤其在實(shí)體瘤的治療上（可參考Weinstein的“binding site barrier”假說(shuō)[1]），但很多情況下，這個(gè)線(xiàn)性關(guān)系是明顯存在的。另外，發(fā)展抗體親和力成熟的技術(shù)，不僅有助于抗體藥物的研發(fā)和質(zhì)量改善，同時(shí)也有助于人們更好地理解抗體與靶點(diǎn)相互作用的機理，更好地認識靶點(diǎn)的功能。
本文中，小編就與大家分享自己對抗體親和力成熟技術(shù)的簡(jiǎn)單總結。本文涉及的技術(shù)內容整理如下，之后的行文將圍繞這個(gè)提綱展開(kāi)：
1. 模擬體細胞高頻突變的抗體親和力成熟策略
BCR基因重排后的成熟B細胞受到抗原刺激后，會(huì )于生發(fā)中心發(fā)生重鏈和輕鏈V區的高頻率突變（主要是點(diǎn)突變），之后再經(jīng)過(guò)FDC捕獲抗原使表達高親和力BCR的B細胞免于凋亡。這一過(guò)程使得后代B細胞的BCR對抗原的平均親和力得到提升。這樣的體細胞高頻突變屬于二次免疫應答，幫助可有效識別抗原的抗體進(jìn)一步成熟，有助于機體有效抵抗外來(lái)抗原的再次入侵。
抗體親和力成熟的策略之一，就是模擬體細胞高頻突變，通過(guò)細胞突變和展示抗體蛋白篩選對抗原高親和的抗體。
1.1 基于B細胞系（人、雞等）高頻突變的篩選策略
Ramos是來(lái)源于人Burkitt淋巴瘤的一株細胞系，在培養過(guò)程中其重排后的免疫球蛋白V區基因持續發(fā)生組成型突變，并表達到膜表面。早在2002年Sarah等人就報道了利用Ramos細胞系篩選出對鏈霉親和素有高親和力的IgM[2]。他們將鏈霉親和素結合到磁珠上，從一群Ramos細胞中篩出對鏈霉親和素有低親和力的細胞群，之后降低磁珠上的鏈霉親和素的密度以提高篩選的苛刻程度，進(jìn)一步篩出親和力更高的突變。之后又進(jìn)一步用標記FITC熒光的鏈霉親和素結合流式分選將抗體親和力進(jìn)一步提高。
隨后，他們對各批次的亞克隆細胞的V區基因做了序列比對，找出了突變位點(diǎn)，分析了抗體與靶點(diǎn)之間的構效關(guān)系：
同在這篇文章中，他們還嘗試了使用XRCC2缺失的雞來(lái)源的B細胞系（DT40），篩選針對多個(gè)抗原的高親和力IgM。該細胞系同樣具有高頻率的V區基因組成型突變，并且比Ramos細胞系增殖時(shí)間更短。篩選結果顯示該細胞系也能實(shí)現IgM的親和力成熟。
以上兩個(gè)例子說(shuō)明合適的B細胞系可以作為工具細胞，用于抗體的親和力成熟。在具體應用中，可以將特定的抗體模板基因插到細胞的免疫球蛋白基因位點(diǎn)，然后進(jìn)行細胞培養和高親和力細胞群的篩選。但基于體細胞高頻突變的抗體親和力成熟技術(shù)有一定的缺陷，至少包括兩點(diǎn)：一是體細胞高頻突變過(guò)程中每個(gè)密碼子中通常只有一個(gè)堿基發(fā)生突變，這嚴重制約了突變后的庫的多樣性；二是由于快速的內部化效應，BCR的親和力往往會(huì )遇到天花板（KD值很難達到0.1 nM以下）。
1.2 基于其他細胞高頻突變的策略研究
基于體細胞高頻突變的抗體親和力成熟的開(kāi)發(fā)，主流方法均是基于B細胞系。B細胞系有其自身的不足，如基因操作比較困難、蛋白的翻譯后修飾特點(diǎn)不能滿(mǎn)足所有外源蛋白的要求等等。于是有實(shí)驗室嘗試在非B細胞系統上實(shí)現親和篩選，以擴充該技術(shù)的細胞系選擇面。如中科院生物物理所杭海英課題組，向人非小細胞肺癌細胞系H1299中導入激活誘導的胞苷脫氨酶（AID），構建H1299-AID穩轉株，然后進(jìn)一步導入抗TNF-α的scFv基因并構建穩轉株，得到的穩轉株進(jìn)行培養和流式分選，獲取高親和力的scFv[3]。
除此之外，還有基于非真核系統的篩選方法，如利用E. Coli的基因增變株來(lái)實(shí)現抗體基因的高頻突變等等，其原理大同小異。
2. 基于抗體庫的親和力成熟策略
基于抗體庫的抗體親和力成熟與基于抗體庫的抗體篩選并無(wú)本質(zhì)差別，均為體外高親和力抗體篩選，重點(diǎn)仍是兩個(gè)方面，即庫的構建和篩選系統的選擇。區別在于，后者所用的庫在構建或合成時(shí)無(wú)偏向性或只具有針對某抗原的有限的偏向性；而前者所用的庫是基于確定的抗體序列模板所構建的。
2.1 建庫策略
建庫的策略可分為兩個(gè)大的類(lèi)別：一類(lèi)是構建較大的庫，將抗體CDR區域甚至整個(gè)V區做隨機突變；另一類(lèi)是構建較小的庫，將突變集中于抗體序列上特定的區域。
大庫構建的方法主要有CDR walking、chain shuffling、DNA shuffling等。CDR walking是指分段隨機突變并保證相鄰兩個(gè)突變區域有所重疊，從而使突變覆蓋整個(gè)CDR區域；chain shuffling是將抗體的VH和VL的配對重新洗牌，而DNA shuffling則是將抗體V區的序列重新洗牌。在DNA shuffling中，突變不限于CDR區，也包括FR區域，因為FR區域對于抗體與抗原的結合也可能有所貢獻。這些方法所構建的庫的容量較大，工作量也較大。
相比大庫的構建，小庫構建更有序列針對性。在沒(méi)有其他信息的情況下，人們習慣優(yōu)先選擇對抗體重鏈CDR3區域進(jìn)行隨機突變，因為重鏈CDR3區域被認為通常對抗原抗體結合起關(guān)鍵作用；但若要真正提高親和力優(yōu)化的效率，還需要更多的信息以幫助人們找出更精確的突變區域。
目前突變區域的選擇主要是基于抗原抗體復合物的結構信息或胚系基因熱點(diǎn)（germline hotspots）的預測。
1）基于抗原抗體復合物的結構信息的突變區域選擇
當抗體抗原復合物的結構被解析之后，我們就可以得知兩者相互作用的位點(diǎn)信息，進(jìn)而進(jìn)行更精確的突變和建庫。
MorphoSys AG2016年發(fā)的文章[4]介紹了他們提高其自身的抗人GM-CSF抗體MOR103的親和力的工作。他們在知悉該抗體與抗原的結合方式后，對抗體的CDR-H2和CDR-L3分別做隨機突變，并用噬菌體展示的方法篩選到高親和力的序列，之后再把篩到的重鏈與輕鏈配對，得到一個(gè)新的“cross-cloned”抗體:
體外GM-CSF和GM-CSFR結合的抑制實(shí)驗比較了這4個(gè)抗體的效價(jià)。另外，他們還分別解析了這4個(gè)抗體與GM-CSF結合的復合物的結構并進(jìn)行比較，探討了構效關(guān)系。
2）基于胚系基因熱點(diǎn)（germline hotspots）的突變區域選擇
Germline hotspots是體細胞高頻突變過(guò)程中的優(yōu)先突變區域，幾乎都處于CDR區域內部，經(jīng)證明對抗體的親和力提高起到關(guān)鍵作用，因此體外親和力成熟時(shí)可優(yōu)先考慮抗體的germline hotspots。
具體的做法是利用數據庫來(lái)比對抗體的序列和抗體胚系基因序列，結合序列相似度和RGYW motifs等坐標性的序列預測出germline hotspots，然后在這些熱點(diǎn)位置進(jìn)行突變，構建小的庫進(jìn)行篩選。早在2009年，Ira Pastan課題組就發(fā)表protocol，以抗CD22的單抗為例，利用germline hotspots預測和噬菌體展示技術(shù)提高抗體的親和力[5]。
至于引入突變的方法，較簡(jiǎn)單的是易錯PCR，但很難達到好的突變效果。另外一種比較流行的就是在引物上設計突變，即人工合成帶有突變區域的引物庫。具體的設計方法有很多，包括控制突變堿基的數目、控制每個(gè)位點(diǎn)各種堿基出現的概率等，以此來(lái)滿(mǎn)足對庫的容量和偏向性的需求。
2.2 篩選方法
基于庫的抗體親和力成熟與基于庫的抗體初步篩選涉及的方法基本相同，主要是利用噬菌體展示、酵母展示、核糖體展示等系統。
噬菌體展示的優(yōu)勢在于操作方便，流程相對簡(jiǎn)易；酵母展示的優(yōu)勢在于與流式分選相結合，檢測和篩選同時(shí)進(jìn)行；核糖體展示的優(yōu)勢是系統容量較大，可用于大庫的篩選，另外可以實(shí)現庫的體外進(jìn)化。這些技術(shù)各有優(yōu)劣，根據實(shí)際需要選擇使用。
參考文獻
Micropharmacology of monoclonal antibodies in solid tumors: direct experimental evidence for a binding sitebarrier. Cancer Research
Generation and iterative affinity maturation of antibodies in vitro using hypermutating B cell lines. Nature Biotechnology
Affinity maturation ofanti-TNF-alpha scFvwith somatic hypermutation in non-B cells. Protein Cell
Molecular basis of in vitro affinity maturation and functional evolution of a neutralizing anti-human GM-CSF antibody. mAbs
In Vitro Antibody Affinity Maturation Targeting Germline Hotspots. Methods MolBiol
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